Nacionalni projekti

Potekajoči nacionalni znanstveno - raziskovalni projekti

Naslov projekta	Individualizacija zdravljenja raka endometrija
Šifra	J3-4523
Vodja	Doc. dr. Jure Knez, dr. med.
Vodilna organizacija	Univerzitetni klinični center Maribor
Projektna skupina
Tip	Temeljni raziskovalni projekt
Trajanje	1.10.2022 – 30.09.2025
Financer	Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije
Vsebinski opis	Rak endometrija je najpogostejši ginekološki rak v razvitem svetu, z incidenco 19,3/100.000 žensk. Z diagnostičnimi postopki, ki so trenutno na voljo, v velikem deležu zaznamo visoko tvegano bolezen, ki je sicer v zgodnjem stadiju. To nakazuje potrebo po orodjih, ki bi bolje ocenila tveganje bolezni ter izboljšala možnosti zdravljenja žensk. V projektu bomo določili molekularne podtipe raka endometrija in jih nato analizirali v povezavi z novimi molekularnimi biomarkerji, kot so CTNNB1 in L1CAM. Na ta način bomo ocenili možnosti izboljašave trenutnih molekularnih klasifikacij. Osredotočili se bomo na raziskave novih translacijskih biomarkerjev za oceno poteka bolezni. Med te vključujemo evkariotske iniciacijske faktorje in evkariotske elongacijske faktorje. V povezavi s temi markerji, bomo bolnicah z rakom endometrija ponudili natančno ultrazvočno preiskavo. Na ta način bomo ocenili predvsem pomen novih ultrazvočnih markerjev, ki jih omogoča sodobna ultrazvočna preiskava za oceno tumorja. Ti markerji bi lahko dodatno pripomogli k boljši oceni tveganja bolnic in izboljšani nadaljnji obravnavi bolezni. V drugem delu projekta bomo raziskali nove, minimalno invazivne metode za izboljšanje diagnostike in karakterizacije bolezni. Osredotočili se bomo na razvoj metode tekočinske biopsije in analize prostocelične DNA pri ženskah z rakom endometrija. Prav tako bomo analizirali možnost tekočinskega citološkega vzročenja endometrija za diagnozo bolezni. Te metode bi lahko ne le izboljšale karakterizacijo bolezni, ampak tudi odprle nove možnosti v preventivi in presajanju raka endometrija v populaciji z visokim tveganjem zbolevanja.1
Bibliografske reference

Naslov projekta	Vpliv različnih kirurških tehnik na molekularne mehanizme razsoja ginekoloških rakov.
Šifra	J3-3069
Vodja	Prof. dr. Iztok Takač, dr. med., višji svetnik
Vodilna organizacija	Univerzitetni klinični center Maribor
Projektna skupina
Tip	Raziskovalni projekt
Trajanje	1.10.2021 - 30.9.2024
Financer	Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije
Vsebinski opis	Vpliv minimalno invazivne kirurške tehnike, zlasti vpliv CO2 pnevmoperitoneja in uporabe manipulatorja pri zdravljenju raka materničnega vratu je trenutno pod drobnogledom zaradi slabega splošnega preživetja v primerjavi s klasično, odprto operacijo raka materničnega vratu. Nedavna multicentrična raziskava je pokazala, da so imeli bolniki, zdravljeni zaradi raka materničnega vratu z laparoskopskim pristopom, večje tveganje za ponovitev in slabše splošno preživetje kot ženske, zdravljene z odprto operacijo. Presenetljiv rezultat je bil edinstven za raka materničnega vratu, saj predhodne klinične raziskave raka endometrija niso pokazale takšnih neželenih izidov različnih tehnik. Nejasen vzrok razlik je povod za natančnejši pregled in razumevanje mehanizmov delovanja. Možno pot razširjanja tumorja med kirurškim posegom predstavlja uporaba CO2 pnevmoperitoneja in manipulatorja. CO2 pnevmoperitonej je bil predhodno ocenjen v študijah z nasprotujočimi si rezultati. Predklinično razumevanje razsoja tumorja z manipulatorjem pa še sploh ni bilo preizkušano. Zato so cilji tega projekta: i) opredeliti spremembe v rakavih celicah izpostavljenih CO2 z uporabo analize genske ekspresije v celičnih kulturah in uporabo RNA-seq; ii) pridobiti razumevanje mehanističnega ozadja imunoloških in vnetnih dogodkov s pomočjo prepoznavanja obnašanja komponent matriksa in adhezijskih molekul (Western blot in RT-PCR); iii) razvoj kirurškomehanični in-vitro model z uporabo in-vitro real time simulacije »strižnega stresa« in »mehanskega stresa«. Naš model raziskovanja omogoča celovito razumevanje vključenih dejavnikov, s poudarkom na globalni ekspresiji genov kot odzivu na CO2 pnevmoperitonej, usmerjenem proučevanju molekularnih interakcij, proučevanju sprememb v komunikaciji celic celične linije in razvoju bolj natančnega modela simulacije uporabe manipulatorja in vpliva le tega na rakave celice. Tako bomo lahko ocenili vpliv laparoskopije na razsoj tumorja in doprinesli do na podlagi dokazov osnovanega odločanja pri kliničnem zdravljenju ginekoloških rakov.
Bibliografske reference

Naslov projekta	Sistemski pristopi k raziskavam človeškega genoma za personalizirano medicino kroničnih imunskih bolezni
Šifra	P3-0427
Vodja	Izr. prof. dr. Uroš Potočnik, univ. dipl. inž. kem. tehnol.
Vodilna organizacija	Univerzitetni klinični center Maribor
Projektna skupina
Tip	Raziskovalni program
Trajanje	1.1.2022 - 31.12.2027
Financer	Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije
Vsebinski opis	Farmakogenomski biooznačevalci za odziv na klasična zdravila (male sintetične molekule) so razmeroma dobro raziskani. Vključujejo predvsem variante v genih za presnovo in transport zdravil (ksenobiotikov) ter se že vpeljujejo v klinično prakso. Variabilnost v odzivu na novejša biološka zdravila je slabše raziskana, hkrati pa predvsem na področju kroničnih imunskih bolezni prihajajo v uporabo vedno nova biološka zdravila za različne molekularne tarče, ki omogočajo izbiro in personalizirano zdravljenje. V okviru raziskovalnega programa želimo molekularne procese in mehanizme poteka bolezni in odziva na zdravljenje raziskati z novimi pristopi sistemske biologije in (bio)medicine, kjer težimo k čim bolj celostni obravnavi bioloških procesov. S pristopi sistemske medicine bomo preučevali molekularne mehanizme neodzivnosti na biološka zdravila pri kroničnih imunskih boleznih (kronična vnetna črevesna bolezen, revmatoidni artritis, luskavica, astma). Raziskali bomo tudi nekatere bolezni, ki povzročajo kronična vnetja in / ali jih zdravimo z modulacijo imunskega odziva, kot sta rak glave in vratu in COVID-19. Pri slednjem bomo med drugim iskali biooznačevalce, ki bodo pomagali določiti za posameznika najučinkovitejše ter najmanj tvegano cepivo. Celovit in podroben vpogled v različne skupine biomolekul in njihovih povezav v signalna, metabolna in druga omrežja v celici na osnovi ogromnega števila podatkov, ki jih bomo pridobili z najsodobnejšo tehnologijo multi-omik, kot so genomika, transkriptomika, proteomika, epigenomika, metabolomika, bomo povezali s kliničnimi podatki. S pomočjo bioinformatske analize bomo razvili modele molekularne patogeneze in odkrili biooznačevalce za klasifikacijo bolnikov na osnovi molekularnih endotipov za spremljanje poteka bolezni in personalizirano medicino. Modele molekularno bioloških procesov bomo nadgradili z integracijo podatkov na različnih nivojih (organel, celica, tkivo, organ, organizem). Z integracijo molekularnih podatkov, kliničnih podatkov in podatkov vplivov okolja bomo izdelali napovedne modele za personalizirano medicino. Raziskave bomo izvajali s pomočjo obsežne biobanke kliničnih vzorcev (DNA, RNA, proteini izolirani iz seruma, sline, blata, urina, brisov sluznic, različnih tkiv), ki vključuje preko 6000 bolnikov, in ki jo razvijamo v skladu z najvišjimi mednarodnimi standardi. Biobanka je povezana z obsežno zbirko kliničnih podatkov bolnikov, vključno z odzivom na zdravljenje. Večjo zanesljivost biooznačevalcev bomo dosegli s predhodnim procesiranjem kliničnih vzorcev za izolacijo posameznih celičnih podtipov. V ta namen skupaj z industrijo razvijamo novo tehnologijo za avtomatizirano, enostavno in cenovno ugodno ločevanje različnih podtipov celic. Novoodkrite biooznačevalce bomo tudi funkcijsko ovrednotili z in vitro celičnimi modeli temelječimi na primarnih celicah bolnikov. Poleg standardnih funkcionalnih celičnih modelov bomo razvijali tudi 3D organoidne modele in v končni fazi organe na čipu.
Bibliografske reference

Naslov projekta	Reprodukcija človeka – laboratorijski in eksperimentalni vidiki
Šifra	P3-0327
Vodja	Prof. dr. Borut Kovačič, univ. dipl.biol.
Vodilna organizacija	Univerzitetni klinični center Maribor
Projektna skupina	Sestava programske skupine
Tip	Raziskovalni program
Trajanje	1.1.2020 - 31.12.2025
Financer	Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije
Vsebinski opis	Raziskovalni program je nadaljevanje laboratorijskih in kliničnih raziskav vezanih na reprodukcijo človeka in uroginekologijo. Del raziskav bo usmerjen v genetske in imunološke vzroke nepravilne signalizacije endometrija v času implantacijskega okna pri ženskah z adenomiozo in endometriozo ter pri preiskovankah z neuspešnimi IVF ciklusi.Morebitno zaznani geni s spremenjenim izražanjem značilnim za adenomiozno skupino bi lahko razložili molekularni vzrok za domnevno spremenjeno receptivnost endometrija pri ženskah s to boleznijo. Raziskava bo vključevala 20 – 30 žensk v preiskovani adenomiozni in tudi v kontrolni skupini. Ultrazvočni pregled in odvzem vzorca endometrija bomo opravili sedmi dan po vrhu LH. Del biopsije bomo uporabili za histološko datiranje endometrija, drugi del vzorca bomo uporabili za izolacijo celokupne RNA in nadaljnjo genetsko analizo. Seznam morebitnih diferenčno izraženih rezultatov pri adenomiozni skupini, ki bi jih zaznali z metodo RNAseq, bomo dalje naložili v bioinformacijska orodja in z metodo genske ontologije določili njihovo molekularno vlogo. V krvi bomo z imunofenotipizacijo s pretočno citometrijo primerjali signalizacijo v FOXP3+ subpopulacijah posamezne bolnice z globoko endometriozo in jo primerjali s kontrolno skupino. Signalne poti bomo spremljali tudi v podvrstah FOXP3+CD4+ T limfocitov, ker predpostavljamo, da so spremembe v teh signalnih poteh lahko v ozadju sprememb homeostaze in funkcije Treg pri pacientkah z endometriozo. Vrednosti Treg in razmerje njihovih subpopulacij bomo ugotavljali tudi med uspešnimi in neuspešnimi ter med naravnimi in spodbujanimi IVF ciklusi. V prospektivni randomizirani raziskavi primerjave vpliva 2% in 5% kisika v atmosferi embrionalnih kultur v IVF postopkih bomo primerjali morfokinetiko razvoja zarodkov in delež kliničnih nosečnosti pri obeh skupinah preiskovancev. Prospektivno randomizirano raziskavo bomo uporabili tudi za primerjavo učinkovitosti dveh metod vitrifikacije blastocist: protokola s kratkotrajnim izpostavljanjem krioprotektantom pri umetno kolabiranih blastocistah in protokola z daljšo ekvilibracijsko fazo pri intaktnih blastocistah. Vitrificirali bomo tudi semenčice. Za primere težkih oblik moške neplodnosti bomo razvijali metode za zamrzovanje majhnega (znanega) števila semenčic. Pri moških z asthenozoospermijo bomo poleg klasičnega spermiograma izmerili tudi delež semenčic z DNK fragmentacijo in oksidativno reduktivni potencial (ORP). Ugotavljali bomo učinkovitost antioksidantih terapij s prehranskimi dopolnili ter analizo na semenu opravili pred in po antioksidantni dieti . Razvili bomo lastno metodo tkivne rezine sečnega mehurja miši in s tem dobili metodologijo, ki nam bo služila za preučevanje fiziologije mehurja in delovanja novih farmakoloških agensov na gladkomišične celice mehurja.
Bibliografske reference	Bibliografske reference projektne skupine

Naslov projekta	Strategija za izboljšanje kvalitete življenja in ortopedskega zdravljenja hrustančnih poškodb – Napredni 3D (bio)tiskani nosilci za tkivno regeneracijo
Šifra	J3-2538
Vodja	izr. prof. dr. Matjaž Vogrin, dr. med.
Vodilna organizacija	Univerzitetni klinični center Maribor
Projektna skupina	Sestava projektne skupine
Tip	Temeljni raziskovalni projekt
Trajanje	1. 9. 2020 – 31. 8. 2023
Financer	Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije
Vsebinski opis	Lezije sklepnega hrustanca predstavljajo velik izziv za ortopede zaradi omejenega lastnega potenciala za celjenje. Trenutne možnosti zdravljenja, ki se uporabljajo v ortopedski praksi za zdravljenje hrustanca, dajejonepredvidljive in pogosto nezadovoljive rezultate. Na mestu poškodbe se oblikuje fibrozno tkivo s slabšimi biokemičnimi in biomehanskimi lastnostmi v primerjavi z zdravim hrustančnim tkivom. Področje regenerativne medicine in hrustančnega tkivnega inženiringa je zbudilo izjemen interes, ker predstavlja alternativno strategijo za obnovo hrustančnega tkiva in obljublja izboljšan klinični izid. Najsodobnejši koncept razvoja združuje uporabo biokompatibilnih in biorazgradljivih nosilnih materialov (nosilcev), aplikacijo rastnih faktorjev, uporabo različnih vrst celic in mehanično stimulacijo. Pomemben vidik oblikovanja nosilcev predstavljajo primerne 3D matrike, ki delujejo kot začetna podpora celicam, da se pripnejo, razmnožijo in oblikujejo svoj značilen zunajceličen matriks. Mikrostruktura nosilcev, ki jih uporabljamo pri hrustančnem tkivnem inženiringu lahko neposredno vpliva na vedenje nasajenih celic in je običajno povezana z mehaničnimi lastnostmi. Zato so se do danes uporabili različnih materiali in tehnike za nadzorovanje omenjenih značilnosti nosilca. Zanimiv pristop pri oblikovanju nosilca predstavlja 3Dbiotiskanje, ki omogoča izdelavo biokompatibilnih in biomehaničnih stabilnih nosilcev z nadzorovanimi dimenzijami por pri različnih oblikah. Manipulacija parametrov 3D biotiskanja in njihova optimizacija, kot tudi primerna izbira mateiala, omogoča izdelavo nosilca z želenimi arhitekturnimi značilnostmi. 3D biotiskanje na osnovi polisaharidov in mešanic polisaharidov v kombinaciji s sintetičnimi materiali omogoča nov vpogled v sposobnost izgradnje hibridnega biočrnila. V okviru tega projekta bomo odvzeli, izolirali in karakterizirali humane celice sklepnega hrustanca, ki jih bomo pridobili iz kirurškega odpada po opravljeni totalni kolenski artroplastiki, izdelali bomo nosilce za hrustančni tkivni inženiring z zgoraj navedeno metodo in ustvarili tkivne konstrukte, ki jih bomo inkubirali pod mehansko stimulacijo. Naše tkivno hrustančne konstrukte bomo karkterizirali z uporabo različnih metod, npr. testom živosti celic, konfokalno mikroskopijo in histološko analizo za ocenjevanje sposobnosti preživetja celic, imunohistokemijo in izražanje specifičnosti genov hrustanca. Dodatno bomo določili mehanske lastnosti in stopnjo razgradnje. Na ta način bomo razvili nove metode za učinkovito regeneracijo hrustanca, ki bi jih potencialno lahko uporabili v klinični praksi v prihodnosti. Z uspešnim zdravljenjem poškodb hrustanca lahko pričakujemo zmanjšano obolevnost za osteoartritisom in posledično izboljšano kakovost življenja pri ortopedskih bolnikih s hrustančno patologijo. Raziskava bo potekala 3 leta. Vljudno vabljeni k sodelovanju.

Naslov projekta	Zgodnje odkrivanje Alzheimerjeve bolezni z novimi biooznačevalci
Šifra	J3-1751
Vodja	Doc. dr. Martin Rakuša, dr. med
Vodilna organizacija	Univerzitetni klinični center Maribor
Projektna skupina	Sestava projektne skupine
Tip	Temeljni raziskovalni projekt
Trajanje	1. 7. 2019 – 30. 6. 2022
Financer	Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije
Vsebinski opis	Alzheimerjeva bolezen (AB) predstavlja več kot polovico vseh demenc in je najbolj pogosto nevrodegenerativno obolenje povezano s staranjem. V Sloveniji je po epidemioloških ocenah okrog 30.000 diagnosticiranih bolnikov z AB. V naslednjih 20 letih lahko pričakujemo, da se bo število bolnikov z AB povečalo za več kot 50% in skupno dosegalo okrog 50.000 bolnikov z AB, kar lahko opredelimo že kot epidemijo. Demence vključno z demenco pri AB predstavljajo javno-zdravstveni problem, ki bo v bližnji prihodnosti tudi veliko moralno in finančno breme za slovensko družbo. Demenca pri AB je definirana kot kognitivni upad na področju spomina in še vsaj enem kognitivnem področju (McKhann et al. 2011). Pri obravnavi je pomembno, izboljšati diagnostične postopke za zgodnje odkrivanje te bolezni. Pri tem si pomagamo z biooznačevalci, kot je npr. invazivna analiza možganske tekočine. Z eno izmed naših prejšnjih raziskav (šifra projekta IRP-2013/01-31) smo uvedli likvorsko diagnostiko demenc v UKC Maribor. Pri tej preiskavi bolnika lumbalno punktiramo in določimo koncentracije amiloida beta, tau in p-tau v likvorju. Danes preiskavo uporabljamo rutinsko pri obravnavi bolnikov z demenco. Patološke procese odkrivamo tudi z neinvazivnimi metodami, ki os različno občutljive. Pri AB pride do strukturnih sprememb možganov in sprememb v prevajanju električnega toka, ki se prično najmanj pet let pred prvimi spominskimi težavam (Apostolova 2016). Prehod iz normalnega, nepatološkega staranja v demenco je postopen in se na samem začetku kaže kot blag kognitivni upad (BKU) na samo enem kognitivnem področju (spomin, jezik, pozornost, vidno-prostorske funkcije, izvršilne funkcije, socialne funkcije). Večina bolnikov z BKU v obdobju enega do treh let napreduje v demenco pri AB. Okvare možganov se klinično kažejo s prizadetostjo različnih kognitivnih področji, ki jih lahko ugotovimo z nevropsihološkim testiranjem. Okvare lahko tudi fizično dokažemo z uporabo difuzijske sekvence (DTS) pri slikanju možganov z magnetno resonančnim tomografom (MR) (Kantarci et al. 2017a), medtem ko lahko tokovne in frekvenčne spremembe prevajanja električnega toka izmerimo z elektroencefalogramom (EEG) ter z dogodkom povezanimi potenciali (Kavcic et al. 2011). Vsaka preiskava posebej ima različno občutljivost. Dosedanje študije na bolnikih so bile usmerjene predvsem v oceno spomina, nekoliko manj pozornosti pa se je posvečalo drugim kognitivnim področjem. Vse opisane metode so neinvazivne in bi lahko združene v bateriji testov služile kot biooznačevalci zgodnje AB. Namen naše raziskave je: 1. Ugotoviti specifične povezave med strukturnimi v beli možganovini in nevrofiziološkimi spremembami med bolniki z AB, BKU in zdravo populacijo. 2. Ugotoviti zgodnje strukturne in nevrofiziološke spremembe pri prehodu bolnikov iz BKU v AB. 3. Razviti baterijo testov za zgodnje odkrivanje AB. V raziskavo bomo vključili priložnostni vzorec 20 zdravih prostovoljcev in vsaj 25 bolnikov z BKU in 25 bolnikov z blago obliko AB. Pri vseh bomo opravili standardne laboratorijske preiskave, nevropsihološko testiranje, MR slikanje možganov in nevrofiziolško testiranje (EEG, VEP-ZG). Preiskovanci bodo opravili dve nalogi. Prva je »Koherenčni dražljaji gibanja« s katero bomo določili minimalni vidni dražljaj, ki ga preiskovanci še zaznajo. V drugi nalogi »Z dogodkom povezani potenciali diskriminacije smeri gibanja«. Raziskava bo potekala 3 leta. Vljudno vabljeni k sodelovanju.
Bibliografske reference	Bibliografske reference projektne skupine
Realizacija	Do marca 2020 smo opravili presejalni obisk pri 15 osebah. V raziskavo smo vključili 12 preiskovancev. Pri vseh smo opravili predvideno psihološko in slikovno diagnostiko. Po protokolu nameravamo bolnike vključevati še leto dni.

Naslov projekta

Identifikacija molekularnih biooznačevalcev za napoved kliničnega poteka in zasevanja pri pacientkah s trojno negativnim rakom dojke

Šifra

J3-9272

Vodja

Prof. dr. Iztok Takač, dr. med., svetnik

Vodilna organizacija

Univerzitetni klinični center Maribor

Projektna skupina

Sestava projektne skupine

Tip

Temeljni raziskovalni projekt

Trajanje

1. 7. 2018 – 30. 6. 2021

Financer

Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije

Vsebinski opis

Trojni negativni rak dojke (TNRD) predstavlja podtip raka dojke (RD) s slabo prognozo. Med vsemi raki dojke predstavlja le ta približno 10-20% letno novoodkritih rakov. Nedavne raziskave še vedno niso uspele odgovoriti na vprašanja najboljšega načina zgodnjega odkrivanja TNBC, napovedne dejavnike kliničnega napredovanja TNRD (agresivnost, potencial metastaziranja) in optimizacijo zdravljenja. Zaradi najmanj natančno definiranih tarč za zdravljenje TNRD od vseh podtipov RD imajo bolniki s TNRD slabo prognozo in veliko tveganje za razvoj lokalne ponovitve RD in pojav metastaz. Zdravljenje TNRD je trenutno zastavljeno zelo agresivno. Vendar raziskave ugotavljajo, da nima vsaka izmed bolnic s TNRD enako agresiven tumor in je potrebno upoštevati molekularni podtip raka dojke. Na podlagi tega kažejo najnovejše ugotovitve, da je potrebno zdravljenje za preprečevanje preveč ali premalo agresivnega zdravljenja personalizirati s pomočjo neinvazivnih metod diagnostike agresivnosti in potenciala mestastaziranja tumorja. Tako so se pojavile potrebe po stratifikaciji in personalizaciji zdravljenja na podlagi dokazov. Namen tega projekta je pridobitev razumevanja o biologiji TNRD s pomočjo integracije genetskih (genotipizacije in odkrivanja proste cirkulirajoče DNA v plazmi), izražanja (RNAseq), epigenetskih (DNA modifikacije) in regulatornih (profiliranje nekodiranih RNA, alternativnih spojev) z bioinformatskimi orodji (genska ontologija). Na podlagi razumevanja biologije TNRD bomo nato lahko ugotovili pomembne biooznačevalce, pomembne v biologiji in značilnostih TNRD. Pričakujemo, da bomo analizirali več kot 150 vzorcev tkiva bolnikov s TNRD. Prospektivno bodo vključeni tudi krvni vzorci in vzorci tkiva, s katerimi bomo dodatno vključili približno 50 bolnic s TNRD. Odkritje bo: i) dopolnilo razumevanje neinvazivnih biomarkerjev pri ugotavljanju agresivnosti bolezni in potencialu metastaziranja, ii) vodilo do razvoja diagnostičnega algoritma, ki povezuje že znane klinične parametre, patološke parametre in genetske / molekularne podatke, in tako omogočilo optimalno metodo zdravljenja pri bolnikih in nadaljnji nadzor bolnikov z diagnosticiranim TNBC in ii) pripomoglo k razvoju tarč za usmerjeno zdravljenje TNRD.

Izvedba	Rezultati	Realizacija
WP1 Pacientke, vzorci in klinični podatki.	V okviru tega delovnega sklopa smo ustvarili bogato podatkovno bazo kliničnih podatkov, ki jih dopolnjujemo s pomočjo določanja novih kliničnih in genetskih markerjev, ki jih določamo s pomočjo tega in ostalih delovnih sklopov. Naše delo je bilo v času od marca 2020 - maja 2020 začasno zaustavljeno zaradi SARS-CoV2 epidemije. Tako smo v tem času imeli težave z rekrutacijo in shranjevanjem novih vzorcev. Verjamemo, da bo s preklicem epidemije in postopnim delovanjem vseh raziskovalnih institucij ta problem razrešen.	60 % zaključen.
WP2 Analiza genske ekspresije v celotnem genomu in tarčne analize izražanja genov.	V okviru delovnega sklopa smo opravili prve analize celokupne RNA, miRNA in DNA. RNA smo začeli analizirati s tarčnimi ekspresijskimi analizami. S povečanjem vzorca bomo optimizirali statistično moč naših analiz in tako lahko tudi uspešneje vključili nove tarčne molekule v napovedni model. V okviru delovnega sklopa smo objavili tudi dodatne prispevke na konferencah.	50 – 60 % zaključen.
WP3. Povezovanje genske ekspresije s podatki genotipizacije.	To je delovni sklop, v katerem smo do sedaj že genotipizirali 135 bolnic. Z mikromrežo GSA smo tako pridobili genotipske podatke za okoli 700.000 SNP-jev za 135 bolnic, z imputacijo nadalje pričakujemo genotipe za okoli 1.500.000 SNP-jev, katere bomo korelirali s podatki genske ekspresije. Trenutno smo v okviru tega delovnega sklopa v fazi bioinformatske analize in korelacije s kliničnimi podatki.	80 % zaključen.
WP4. Epigenetske analize za identifikacijo	Z optimizirano metilacijsko analizo z metodo analize talilne krivulje visoke ločljivosti (MS-HRM) smo opravili prve metilacijske analize. Z nadaljnjimi metilacijskimi analizami bomo tako omogočili robustnejše epigenetske analize metilacijskih biomarkerjev.	40 % zaključen.
WP5. Analiza cirkulirajoče tumorske DNA v plazmi. WP6. Statistična obdelava podatkov ter integracija kliničnih, patoloških in molekularnih parametrov v napovedni model.	Večji delež vsebin se bo izvedel tekom nadaljevanja projekta, saj temelji na lastnih rezultatih. V okviru trenutnega delovanja WP 6 smo tudi že predstavili na konferencah naše prve izsledke.	Z napredovanjem dela na delovnih sklopih WP1-WP5 pridobivamo dragocene informacije za razvoj in testiranje napovednega modela za zdravljenje TNRD. Ocenjujemo, da smo glede na pridobljene podatke v okviru raziskovalnega projekta in podatke, ki jih bomo še analizirali oz. vzorec bolnic, ki ga bomo povečali tekom raziskave, dosegli 30 % predvidenih vsebin v delovnem sklopu.

Objave in izsledki:

SOBOČAN, Monika, TURK, Maja, ČATER, Pija, ČAS-SIKOŠEK, Nina, CRNOBRNJA, Bojana, TAKAČ, Iztok, ARKO, Darja. Clinical features and their effect on outcomes of patients with triple negative breast cancer with or without lymph node involvement. JIMR on-line, ISSN 1473-2300, 2019, vol. , no. , str. [1]-9, ilustr. https://journals.sagepub.com/doi/full/10.1177/0300060519887259, doi: 10.1177/0300060519887259. [COBISS.SI-ID 6873663]

M. Sobočan, Ž. Ledinek, B. Crnobrnja, N. Čas Sikošek, N. Fokter Dovnik, R. Kavalar, J. Knez, I. Takač. "The value of uPA and PAI-1 levels in triple negative breast cancer"

CVIKL, Janina Gea, REPNIK, Katja, TAKAČ, Iztok, POTOČNIK, Uroš. Comparison of three methods for DNA extraction for SNP genotyping in breast cancer patients. V: PINTAR, Albin (ur.). Zbornik povzetkov = Book of abstracts. 25th Annual Meeting of the Slovenian Chemical Society, 25.-27. september 2019, Maribor, Slovenija. Ljubljana: Slovensko kemijsko društvo, 2019. Str. 160. ISBN 978-961-93849-6-1. [COBISS.SI-ID 22628886]

CVIKL, Janina Gea, REPNIK, Katja, TAKAČ, Iztok, POTOČNIK, Uroš. Comparison of three methods for DNA extraction from tissue samples and blood lymphocytes of breast cancer patients. V: KLJUN, Jakob (ur.), PALJK, Tina (ur.). Communicating in science : book of abstracts. Cutting Edge, scientific conference for young researchers, 17. 9. 2019. Ljubljana: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2019. Str. 66. ISBN 978-961-7078-04-6. [COBISS.SI-ID 22599702]

SKOK, Kristijan, GRADIŠNIK, Lidija, ČELEŠNIK, Helena Sabina, POTOČNIK, Uroš, KAVALAR, Rajko, TAKAČ, Iztok, MAVER, Uroš. Isolation and characterization of the first Slovenian human triple-negative breast cancer cell line. The breast journal, ISSN 1524-4741. [Online ed.], 2019, vol. , no. , str. 1-3, ilustr. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tbj.13695, doi: 10.1111/tbj.13695. [COBISS.SI-ID 6854207].

ČELEŠNIK, Helena Sabina, POTOČNIK, Uroš. Limitations of 5-Aza-dc-treated DNA as unmethylated standard and optimization of methylation controls for Methylation-sensitive high resolution melting analyses. V: REŽEN, Tadeja (ur.). Book of abstracts. 1st electronic ed. Ljubljana: University of Ljubljana, Faculty of Medicine. 2019, str. 27. http://cfgbc.mf.uni-lj.si/2019eracosysmed/. [COBISS.SI-ID 512906040]

ČELEŠNIK, Helena Sabina, BJELIĆ, Dragana, SOBOČAN, Monika, TAKAČ, Iztok, POTOČNIK, Uroš. Correlation of genetic and epigenetic biomarkers for prognosis of triple negative breast cancer progression and invasiveness. V: SKOČAJ, Matej (ur.). Genetika 2018 : book of abstracts, 8th Congress of the Genetics Society of Slovenia [and] 8th Meeting of the Slovenian Society of Human Genetics, September 19-21, 2018. Ljubljana: Slovensko genetsko društvo: = Genetics Society of Slovenia. 2018, str. 117. https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?id=114563&lang=slv. [COBISS.SI-ID 512837432]

CRNOBRNJA, Bojana, KNEZ, Jure, SOBOČAN, Monika, ČAS-SIKOŠEK, Nina, VOGRIN, Veronika, REPNIK, Katja, HEITZER, Ellen, POTOČNIK, Uroš, TAKAČ, Iztok. Free-cell tumor DNA as a biomarker for early breast cancer. International journal of gynecological cancer. [Online ed.]. 2019, vol. 29, suppl. 4, str. a178. ISSN 1525-1438 [COBISS.SI-ID 6829119].

SOBOČAN, Monika, BELAK, Urška, ČAS-SIKOŠEK, Nina, KOZAR, Nejc, KRAJNC, K.K., TAKAČ, Iztok, ARKO, Darja. The predictive value of NHS PREDICT for triple negative breast cancer. Annals of oncology, ISSN 1569-8041. [Online ed.], May 2019, vol. 30, suppl. 3, str. III70. [COBISS.SI-ID 6673983]

Diplomska naloga:

Analizirali smo nekaj kandidatnih polimorfizmov v genih MMP1, MMP2, MMP3, MMP7 in MMP9, ki smo jih genotipizirali z metodo talilne krivulje visoke ločljivosti (angl. HRM, High Resolution Melting), na primer rs1799750 ter rs498186 v genu MMP1, rs3918242 ter rs17577 v genu MMP9 (1. diplomska naloga), ki sta pokazala povezavo z nastankom raka dojk, rs650108 v genu MMP3 pa je pokazal povezavo s starostjo ob diagnozi. Prav tako smo tarčno analizirali nekatere somatske mutacije, npr. znotraj gena TP53 (2. diplomska naloga)

Bibliografske reference

Bibliografske reference projektne skupine

Naslov projekta

Napredne genomske analize slovenskih otrok z motnjami avtističnega spektra

Šifra

Z3-9294

Vodja

Asist. dr. Danijela Krgović, univ. dipl. biokem.

Vodilna organizacija

Univerzitetni klinični center Maribor

Projektna skupina

Sestava projektne skupine

Tip

Podoktorski raziskovalni projekt (zaključen)

Trajanje

1. 7. 2018 – 1.12. 2020 (zaključen)

Financer

Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije

Vsebinski opis

Zaradi tehnološkega napredka je v zadnjih nekaj letih na področju genetike MAS (motnje avtističnega spektra) dosežen viden napredek. Trenutno je prva metoda izbora v genetski diagnostiki otrok z razvojno–nevrološkimi motnjami, med katere uvrščamo tudi MAS, molekularna kariotipizacija, ki omogoča detekcijo strukturnih genomskih variabilnosti z diagnostičnim izplenom 15-20% (Miller DT, et al., 2010).

Cilj naše raziskave je bila vpeljava najnovejše tehnologije, sekvenciranje nove generacije (metoda NGS), ki omogoča določanje prisotnosti redkih genetskih različic (SNV), kot dodaten genetski vzrok nastanka MAS. V našo raziskavo smo vključili 148 otrok s postavljeno klinično diagnozo suma MAS. Analize z metodo NGS smo izvedli le pri preiskovancih, pri katerih z molekularno kariotipizacijo nismo mogli pojasniti nastanka motnje.

Rezultati analize NGS so pokazali, da je skoraj 11% preiskovancev nosilcev redke na novo nastale patogene različice, ki pojasni etiologijo njihove bolezni. Redko patogeno ali verjetno patogeno različico v genih povezanih z razvojno- nevrološkimi motnjami smo določili pri 28,4% slovenskih otrok s sumom na MAS, kar je višji izplen od molekularne kariotipizacije. S pomočjo študije smo tako določili možen genetski vzrok za MAS pri znatno višjemu številu pacientov in s tem pripomogli k boljši napovedi bolezni pri otroku ter boljših možnosti zdravljenja.

Pri 10–15% bolnikov z MAS so vzrok za nastanek motnje mendelska bolezen ali nek genetski sindrom. Novejše genetske metode, kot so molekularna kariotipizacija, so omogočile detekcijo strukturnih genomskih variabilnostih (SGV). SGV so mikroduplikacije in mikrodelecije v genomu, ki lahko pojasnijo genetski izvor MAS pri kar 15-20% bolnikov. Ker je uvedba molekularne kariotipizacije v diagnostiki razvojno–nevroloških motenj bistveno povečala število posameznikov, pri katerih so lahko določili genetski vzrok nastanka motnje, je ta postala prva metoda izbora pri diagnosticiranju otrok z duševno manjrazvitostjo, razvojnim zaostankom, s prirojenimi nepravilnostmi in z MAS (Miller DT, et al., 2010). Vendar, kljub intenzivni genetski obravnavi otrok z razvojno–nevrološkimi motnjami, pri skoraj polovici obravnavanih ostaja vzrok motnje še vedno nepojasnjen. Najnovejše tehnike, kot je metoda sekvenciranja naslednje generacije ( angl. next-generation sequencing - NGS), ki omogočajo bistveno natančnejše proučevanje humanega genoma kot katerakoli genetska metoda do sedaj (na nivoju posameznega baznega para), obljubljajo še boljše razumevanje etiologije MAS. Uporaba metode NGS pri bolniki z MAS je pokazala prisotnost redke genetske različice oz. mutacije vpletene v genetiko MAS pri več kot 8% obolelih, pri katerih genetskega vzroka prej niso mogli določiti (Geschwind DH et al., 2015; Bourgeron T., 2016).

V okviru večletne študije, smo v Laboratoriju za medicinsko genetiko, UKC Maribor, izvedli oceno molekularne kariotipizacije kot diagnostične metode pri slovenskih otrocih z razvojno- nevrološkimi motnjami. Med njimi, je bilo v našo raziskavo vključenih 159 otrok z MAS. Z uporabo molekularne kariotipizacije smo določili prisotnost SGV, ki lahko pojasni genetski vzrok motnje, pri 12,6% preiskovancev. Rezultati opravljene študije so bili predstavljeni v okviru doktorske disertacije (COBISS.SI-ID 512489016).

Ocenjuje se, da bi z uvedbo metode NGS v diagnostiko MAS, bil diagnostičen izplen metode primerljiv ali večji od molekularne kariotipizacije, ki trenutno velja kot prva metoda izbora. Tako bi lahko z natančnejšo NGS analizo genoma pojasnili nastanek motnje pri vsaj še 10-20% slovenskih otrok.

Cilji naše raziskave je slonel na proučevanju prisotnosti redkih genetskih različic z metodo NGS pri slovenskih otrocih z nepojasnjeno MAS ter uvedbi te metode v diagnostiko razvojno- nevroloških motenj. Pri tem smo se predvsem osredotočili določevanju vpliva analizirane različice na razvoj motnje pri posamezniku in postavitve genotip–fenotip povezave. Raziskava nam je prav tako omogočila oceno učinkovitosti (diagnostični izplen) uporabe metode NGS. Da bi zagotovili učinkovito doseganje ciljev projekta smo projekt razdelili v 5 delovnih procesov (WP1- WP5).

Načrt izvedbe projekta in časovna razporeditev

Izvedba projekta	Pričakovani rezultati	Realizacija
WP1.Klinična ocena bolnikov	Klinična ocena preiskovancev se je izvedla rutinsko, v okviru redne diagnostike, s strani odgovornega pediatra ali kliničnega genetika v LMG, UKC MB in je ključnega pomena za interpretacijo in nadaljnjo obravnavo pacienta v primeru določitve potencialno klinično pomembnega SNV (postavljanje genotip-fenotip korelacij). V raziskavo smo vključili 148 otrok, napotenih v Laboratorij za medicinsko genetiko Univerzitetnega kliničnega centra Maribor (LMG, UKC MB) od leta 2010 do 2018 s postavljeno klinično diagnozo sum na MAS pri katerih z molekularno kariotipizacijo nismo mogli pojasniti nastanka motnje. V vseh primerih so starši/skrbniki preiskovancev bili ob redni diagnostični obravnavi seznanjeni z možnostjo poteka raziskave in so podpisali izjavo o zavestni privolitvi k sodelovanju v njej (privolitveni obrazec LMG OB 75 GL 202). Klasifikacija klinične slike se je izvedla s pomočjo formalne ontologije človeških fenotipov – HPO klasifikacija ( angl. Human Phenotype Ontology).	100%
WP2.Sekvenciranje naslednje generacije (NGS)	Z metodo NGS smo izvedli sekvenciranje kodirajočega dela genoma (angl. whole exome sequencing – WES) pri 148 otrocih in 88 starših, med katerimi je bilo 11 družin, kjer se je MAS pojavil pri dveh ali več sorojencih. Metoda WES nam omogoča analizo SNV v več kot 25.000 genih, vendar za mnoge gene natančna funkcija in mehanizem delovanja niso poznani, zato je za diagnostiko smiselno proučevati gene povezane z MAS z jasno genotip-fenotip korelacijo ter znanim način delovanja. Posledično smo v analizo vključili 1150 genov vpletenih v razvoj razvojno- nevroloških motenj. Nabor le-teh smo izvedli na podlagi na spletu dosegljivih podatkovnih baz, kot sta SAFARI Gene in AutDB ter literature. Določene SNV smo pri preiskovancih analizirali s komercialno dostopnim programom Illumina VariantStudio v3.0, ki omogoča analizo dobljeni VCF ( angl. variant call files) datotek ustvarjenih tekom sekvenciranja. V končno analizo je tako bilo vključenih več kot 39.000 SNV različic določenih pri 148 pacientih in 88 starših. Od tega smo v nadaljnjo analizo vključi le redke SNV, se pravi le tiste, ki imajo frekvenco pojavnosti v splošni populaciji v manj kot 1% ljudi.	100%
WP3.Potrjevanje določenih SNV in izključevanje dednosti	V primeru detekcije redkih SNV, smo različice zaradi narave metode NGS (možno lažnih pozitivnih rezultatov) potrdili s alternativno molekularno metodo, sekvenciranje po Sangerju. V okviru raziskave je bilo s sekvenciranjem po Sangerju potrjenih 189 redkih različic pri preiskovancih in njihovih družinskih članih. Določanje dednosti različice je ključnega pomena za določevanje njihovega kliničnega pomena.	90%
WP4.Analiza in vrednotenje določenih SNV s pomočjo bioinformatičnih orodij	Oceno klinične pomembnosti preiskovanih SNV smo izvedli v skladu s priporočili in smernicami Ameriške fakultete za medicinsko genetiko - ACMG (Richards et al., 2015), ki različice glede na njihov kliničen pomen razvršča v 5 kategorij: patogeni SNV, verjetno patogeni SNV, SNV z nejasnim kliničnim pomenom ( angl. variant with unknown significance – VUS), verjetno benigni ter benigni SNV. Oceno klinične pomembnosti smo izvedli za vseh 39.000 SNV različic določenih pri 148 pacientih. Pri redkih različicah, ki so bile opredeljene kot SNV z nejasnim kliničnim pomenom, verjetno patogeni in patogeni SNV, smo se osredotočili na določevanje vpliva analizirane različice na razvoj motnje pri posamezniku in postavitvi genotip–fenotip povezave. Rezultati analize NGS so pokazali, da je skoraj 19% preiskovancev (N=28/148) nosilcev redkih patogenih in 9,5% preiskovancev (N=14/148) verjetno patogenih genetskih različic (SNV) v genih, ki lahko pojasnijo etiologijo njihove bolezni. Od tega smo z analizo segregacije različice pri starših določili, da je preiskovana različica pri 11% (N=16/148) preiskovancev nastala na novo. Ocenjena učinkovitost (diagnostični izplen) uporabe metode NGS v diagnostiki slovenskih otrok z MAS tako znaša 28,4% in je večja od izplena molekularne kariotipizacije. Delni rezultati analiz so bili predstavljeni v obliki prispevkov na 69. letnem kongresu Ameriškega združenja za humano genetiko, Huston, 2019 [1] in evropskem kongresu združenja za humano genetiko leta 2020 [2].	100%
WP5. Preučevanje signalnih poti	WP5. Preučevanje signalnih poti Opisi pacientov z enako ali podobno klinično sliko, ki so nosilci sprememb v istih genih, vodijo k odkrivanju vpliva določenega gena v etiologiji proučevane bolezni in proučevanju molekulskih poti, interakcij vpletenih genov in iskanju skupnih signalnih poti, ki pripomorejo k nadaljnjem razumevanju nastanka kompleksnih bolezni kot je MAS. Z orodjem Orval so bile analizirane redke kodirajoče različice, ki so skupne vsem obolelim otrokom v vsaki od družin z več obolelimi z motnjami avtističnega spektra (MAS), z namenom da bi odkrili potencialno patogene kombinacije teh različic. Na ta način smo pri eni od družin odkrili drugačnosmiselni različici v genih XRCC3in ADCY2, ki utegneta vplivati na pojav fenotipa MAS pri teh otrocih. Gena sta že bila povezana z razvojno-nevrološkimi motnjami v asociacijskih študijah celotnega genoma. XRCC3 je bil povezan z avtizmom, ADCY2 pa z bipolarno motnjo [3]. Dobljeni rezultati so del doktorske naloge, ki se opravlja v okviru raziskovalnega programa ARRS P4-220 Primerjalna genomika in genomska biodiverziteta.	40%
	V izvedbi projekta tekom izvajanja ni prišlo do spreminjanja projektne skupine in ni prišlo do spreminjanja vsebinskih poudarkov projekta

Programi in projekti ARRS, kjer je UKC Maribor sodelujoči partner

ŠIFRA	NASLOV PROJEKTA	TRAJANJE	VODJA V UKC MB
P2-0046	Separacijski procesi in produktna tehnika	1.1.2004―31.12.2024	Prim. izr. prof. Artur Pahor, dr. med
P3-0036	Bio-psiho-socialni model kvalitete življenja	1.7.2004―31.12.2021	Doc. dr. Jernej Dolinšek, dr. med.
P3-0321	Napovedni dejavniki poteka bolezni in odgovori na zdravljenje pri različnih vrstah raka	1.7.2004―31.12.2025	Prof. dr. Iztok Takač, dr. med., svetnik
P3-0352	Družine s povišano ali visoko ogroženostjo za raka: svetovanje, odkrivanje mutacij in preprečevanje raka	1.1.2018 - 31.12.2023	Prim. doc. dr. Bogdan Čizmarević, dr. med
P4-0220	Primerjalna genomika in genomska biodiverziteta	1.1.2020 - 31.12.2025	Prof. dr. Nadja Kokalj Vokač, univ. dipl. biol.
J3-1762	Nov inovativen pristop k zdravljenju pleničnega izpuščaja z uporabo plenic z vgrajenimi probiotičnimi bakterijami	1.7.2019 -30.06.2022	Prof. dr. Nataša Marčun Varda, dr. med.
J2-1725	Pametni materiali za bioaplikacije	1.7.2019 - 30.06.2022	Prim. izr. prof. Artur Pahor, dr. med
J3-9258	Molekularno genetski biooznačevalci in mehanizmi neodzivnosti na biološko zdravljenje zanti-TNF bolnikov s kroničnimi imunskimi boleznimi	1.7.2018 - 30.06.2021	Prof. dr. Pavel Skok, dr. med.
J3-9434	Novi pristopi k prepoznavi in preprečevanju samomorilnega vedenja in drugih dejavnikov tveganja na področju duševnega zdravja mladostnikov	1.7.2018 - 30.06.2021	Izr. prof. dr. Hojka Gregorič Kumperščak, dr. med.